流感中和抗体假病毒

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本产品是基于慢病毒包装系统，以人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）为骨架，表面镶嵌流感病毒衣壳蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），可自我组装并包裹装载双报告基因的质粒，形成病毒样颗粒（Virus-like Particle，VLP）。该假病毒结构高度类似活病毒，可模拟真病毒与受体结合并诱导膜融合进入细胞的过程。该假病毒具有单轮感染能力，感染特定细胞系后可表达绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶（Luciferase），安全性好。

检测原理

中和抗体可由感染病原体或接种疫苗产生，可以特异识别病毒表面的抗原位点，阻止病毒入侵细胞繁殖，保护机体免受其害，具有真正的抗病毒作用。该流感病毒假病毒含有病毒的中和抗原，且具有感染细胞活力。有中和活性的样品在与假病毒作用后，会丧失感染细胞的能力。通过Elispot读数仪扫描计数每孔的荧光斑点数，或多功能酶标仪读取每孔的荧光素酶表达量，将待测样品孔的数值与假病毒对照组的数值进行比较，可判断样品是否具有中和活性，并计算出样品的有效作用浓度。计算50%假病毒被抑制时抗体的稀释倍数的倒数即中和抗体滴度。

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产品应用

• 抗流感病毒血清中和抗体效价测试；
• 抗流感病毒单克隆抗体滴度检测。

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产品系列

提供H5N1L（FNV-H5N1LG，GFP+Luciferase双报告）与H7N9（FNV-H7N9L，Luciferase报告）两种流感病毒中和抗体假病毒，用于抗流感病毒血清中和抗体效价测试。

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实验材料

实验试剂：靶细胞、DMEM、胎牛血清、PBS、0.25%胰酶、FBE001、血清或抗体、荧光素酶检测试剂盒。

实验设备：生物安全柜、荧光倒置显微镜、CO₂细胞培养箱、离心机、多功能酶标仪、Elispot读数仪、水浴锅、移液器（单道、多道）、电动移液器、96孔板、酶标板。

实验步骤（以血清样本为例）

1. 感染前一天下午细胞铺板：取对数生长期的靶细胞进行胰酶消化，计数后使用5% FBS的DMEM培养基制成1×10⁵ cells/mL细胞悬液，96孔板接种100 µL/孔细胞液（或铺孔细胞密度为20%），置于37℃、5% CO₂细胞培养箱中继续培养。
2. 感染当天上午样品准备（细胞密度汇集至30%-40%时）：a）血清样品置于56℃水浴锅中灭活30 min-1h；单抗起始浓度调至300μg/ml。b）稀释：使用DMEM培养基对血清样本进行稀释，分别进行梯度稀释，作为独立血清样品或单抗样品进行中和抗体检测。
3. 假病毒稀释：从-80℃超低温冰箱中取出假病毒置于冰上或4℃条件下融化，待其完全融化后短暂离心，使病毒液聚集于保存管底，依据报告中假病毒滴度和实验方案设计使用无血清DMEM培养基进行系列稀释（1TCID50=1荧光斑点）；建议96孔板每孔加入4000 TCID50假病毒液。
4. 待测样品和假病毒稀释液预孵育：将稀释的待测样品与假病毒稀释液进行等体积混合，同时设置细胞对照（无血清DMEM培养基，100 µL/well）、假病毒对照（假病毒稀释液与无血清DMEM培养基等体积混合），放入37℃、5% CO₂培养箱中孵育1 h。
5. 感染细胞：孵育结束后各取100 µL混合液（包括细胞对照、假病毒对照、实验组）+1 µL 100×FBE001混匀贴壁缓慢加入已经接种好细胞的96孔板对应孔中，贴着工作台面轻轻划“十”字混匀，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养72h（感染12h时需补液100 µL 1% FBS DMEM完全培养基）。
6. 感染检测：病毒感染细胞72 h后，取出96孔板置于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达效率，拍照记录。检测方法一：使用Elispot荧光斑点计数仪进行检测，计算感染抑制率（%）；检测方法二：从孔板中吸弃150 µL上清，加入100 µL室温平衡后的荧光素酶检测试剂，充分吹打混匀后，从每孔中吸取100 µL反应液转移至酶标板中对应孔位，使用酶标仪检测其发光值，注意在20 min内完成检测。（两种检测方法可以只选择一种，依据客户需求设置。）
7. 结果判定：中和抗体检测实验过程中需设置假病毒对照、细胞对照，来判定实验是否成立。

注意：测试假病毒感染靶细胞效率时可跳过步骤2-4，每孔取10 µL假病毒+100 µL 1% FBS DMEM培养基混匀后加入已铺细胞过夜的96孔板中，感染超过12h补液100 µL 1% FBS DMEM完全培养基，72h观察荧光比例和检测双荧光素酶的含量。

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注意事项

1. 冻融会导致假病毒的稳定性降低，从而影响核酸抽提的效果及QPCR检测结果，使用时应避免反复冻融；
2. 病毒灭活处理可能会导致DNA的降解，请根据实际实验需求合理选择；
3. 如果需要对本产品进行稀释处理，可以使用TE（10mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）缓冲液进行稀释；
4. 如果使用时本品不慎溅到眼睛、皮肤或其他身体部位请立即使用大量清水冲洗；
5. 使用本品所产生的实验废弃物需要通过高压灭菌处理后按照医疗废弃物处理要求处理。

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Q1：流感中和抗体假病毒主要用于什么研究？
\nA：主要用于流感病毒抗体评价、疫苗免疫效果分析、抗体筛选及病毒进入机制研究。

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Q2：流感假病毒检测主要关注哪些指标？
\nA：通常关注抗体对假病毒感染过程的抑制能力，用于评价抗体的中和活性及功能效果。

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Q3：流感假病毒可以覆盖不同亚型吗？
\nA：可以根据研究需求设计不同流感病毒相关表面蛋白体系，用于不同亚型抗体评价。

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